Western Blot 實驗原理：蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot，也稱Western、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。
與 Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗 體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋 白水平的表達(dá)。
Western Blot 實驗步驟：樣品制備、上樣與電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育和檢測
Western Blot 實驗試劑：
樣品制備
蛋白定量
應(yīng)用: WB;Dot;ELISA 推薦稀釋濃度: 1:500-1:5000
同種型：小鼠lgG 特異性：適用所有物種
Bradford 法是最簡單和快速的比色蛋白定量方法，Bradford 方法進(jìn)行了改良，最大限度的加大蛋白定量的線性范圍，變異性小于普通考馬斯亮藍(lán)染色法，靈敏度范圍為 100～1500 μg/mL。
BCA蛋白定量試劑盒,45分鐘內(nèi)可完成測定，蛋白質(zhì)測定范圍是20～2000 μg/mL。
注：用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定由RIPA裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
孵育盒
凝膠溶液
電泳及上樣緩沖液
蛋白Marker
染色液
轉(zhuǎn)膜緩沖液
轉(zhuǎn)印膜
酶標(biāo)二抗
二抗建議稀釋范圍:
免疫組化/免疫化學(xué)：1:500 - 1:5,000
ELISA 和 WB(顯色底物)：1:5,000 - 1:100,000
WB(ECL化學(xué)發(fā)光底物)：1:10,000 - 1:200,000
防腐劑：無添加 (疊氮化鈉作為防腐劑的使用將大大抑制辣根過氧化物酶的酶活性)。
封閉
內(nèi)參及標(biāo)簽抗體
應(yīng)用: WB;Dot;ELISA 推薦稀釋濃度: 1:500-1:5000
同種型：小鼠lgG 特異性：適用所有物種
顯色試劑
拜爾迪超敏化學(xué)發(fā)光液是一種基于魯米諾的超靈敏、極低背景的化學(xué)發(fā)光檢測底物溶液。通過加入促進(jìn)化學(xué)發(fā)光信號的復(fù)合增強劑，對蛋白印跡實驗中辣根過氧化物酶的檢測具有極高靈敏度，可以檢測到≤0.05ng/ml 濃度的 HRP。
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